Thời trẻ, Huỳnh Tịnh Của đi du học tại một trường công giáo ở Penang, Malaysia. Sớm tiếp thu tư duy nghiên cứu khoa học phương Tây, ông tinh thông cả tiếng Hán và tiếng Pháp. Năm 1861, Huỳnh Tịnh Của được bổ nhiệm Ðốc phủ sứ, làm Giám đốc ty phiên dịch văn án ở Soái phủ Sài Gòn. Ngoài công việc của một viên chức chính phủ, ông còn lưu tâm giành nhiều thời gian nghiên cứu chữ quốc ngữ. Năm 1865, ông thay Trương Vĩnh Ký làm chủ bút tờ công báo quốc ngữ Gia Ðịnh báo trong một thời gian ngắn.
Mặc dù tinh thông cả Pháp văn lẫn Hán văn, tuyệt đại đa số các tác phẩm của ông được viết bằng chữ quốc ngữ, vào thời bấy giờ vẫn chưa được coi trọng và bị đánh giá thấp hơn so với chữ Hán hay chữ Pháp. Huỳnh Tịnh Của từng đề nghị dùng chữ quốc ngữ thay cho chữ Hán và gửi một bản điều trần cho vua Tự Đức, yêu cầu cho xuất bản báo chí quốc ngữ để giáo dục quần chúng, nhưng không được chấp nhận.
Tiếp nhận ảnh hưởng văn hóa phương Tây, Huỳnh Tịnh Của cùng chia sẻ một quan niệm với Trương Vĩnh Ký, theo đó, xã hội Việt Nam có khả năng và cần vận dụng các kiến thức và kinh nghiệm của học thuật phương Tây về các vấn đề khoa học, kỹ nghệ, kinh tế và chính trị, để canh tân, nhưng vẫn giữ gìn, đào sâu và phát triển văn hóa phương Đông cổ truyền để duy trì bản chất và bảo tồn độc lập.
Ông là một trong số ít người “Tây học” đầu tiên trước tác bằng chữ quốc ngữ để truyền bá học thuật phương Tây, nhưng vẫn không quên phổ biến văn hóa phương Đông cổ truyền. Sau và cùng với Trương Vĩnh Ký, Huỳnh Tịnh Của là người có công xây đắp rất nhiều cho nền văn chương quốc ngữ trong những bước đầu, nhất là ở Nam Kỳ.
Ông mất năm Đinh Mùi (1907), thọ 73 tuổi, an táng tại Bà Rịa.
