Họa mi trống và mái có cùng màu sắc, dáng vóc tương tự nên phân biệt rất khó. Cho nên trong giới nghệ nhân có câu nói: “Họa mi không hót, thần tiên cũng khó biết được!”. Để phân biệt họa mi trống, mái thông thường chỉ có cách “quan sát” tiếng hót của chúng. Một số người cho rằng chim có lông màu đen, hoa văn sọc rằn sáng rõ ở trên lưng và trước ức là con trống, nếu không có màu rõ ràng là con mái. Và còn có một số nhận định, như sau:

Con trống thân hình to và dài hơn con mái

- Đầu con trống lớn rộng, đầu con mái hẹp ở hai bên, tròn, nhỏ.

- Cặp giò của con trống cứng cáp, to.

- Cục thịt u của ngón chân sau của con trống lớn hơn.

Nhưng thực tế, những nhận xét như vậy chỉ đạt yêu cầu chuẩn xác 8/10 với phương pháp: Chỉ bằng cách nghe tiếng hót của chúng để phân biệt chính xác nhất. Tiếng hót líu của chim trống luyến láy trầm bổng, âm điệu lanh lảnh cao, phong phú về âm hưởng, chim mái giọng chỉ đơn điệu xùy, xùy…